Verbundforschungsprojekte (2019-2022)

Gefördert durch

Screening new to nature libraries of diterpenoids generated by synthetic biology for novel anti-tumor activities - COMBIOSCREEN

Prof. Dr. Alain Tissier (Leibniz Institut für Pflanzenbiochemie) in Kooperation mit PD Dr. Margret Köck  (Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg)

Pflanzlich sekundäre Metaboliten sind immer noch eine sehr wichtige Quelle für Arzneimittel. Dies ist sowohl auf die enorm strukturellen Diversität dieser Substanzen als auch auf ihre Rolle in der Anpassung der Pflanzen an ihrer Umwelt zurück zu führen. Dennoch ist bisher nur ein kleiner Teil dieser Diversität untersucht und ausgeschöpft worden, weil viele Pflanzen noch nicht analysiert wurden und das Potenzial einzelner Pflanzenspezies, bisher unbekannte Substanzen zu produzieren, erst kürzlich anerkannt wurde. Die Verfügbarkeit von genomischen Sequenzen hat die Existenz von Stoffwechselwegen enthüllt, die nach den bisher durchgeführten Metaboliten-Analysen nicht vorausgeahnt werden konnten. Mit den neuen Sequenzierungstechnologien ist der Zugang zu diesem Schatz von neuen Enzymen einfacher geworden. Dennoch stellt die Zusammensetzung dieser Biokatalysatoren in funktionellen Stoffwechselwege eine große Herausforderung dar.

Terpene, mit über 50,000 Strukturen, stellen die zahlreichste Metaboliten-Klasse in Pflanzen dar. Sie sind u.a. als Aroma-, Duft- oder Arzneistoffe eingesetzt. Besonders Diterpene, die aus 20 Kohlenstoff bestehen, zählen mehrere aktive Stoffe in ihren Reihen. Taxol zum Beispiel wird seit über 20 Jahre als Anti-Tumor Wirkstoff benutzt und kürzlich wurde Ingenolmebutate als Arzneimittel gegen aktinische Keratose zugelassen. Die Biosynthese von Terpenen folgt einem modularen Muster, in dem die Terpen-Synthase den ersten Schritt katalysiert und dadurch die strukturelle Diversität erzeugt. Die Terpen-Gerüste sind dann oft an mehreren Stellen oxidiert, was von Cytochrom-P450 Monooxygenasen oder Dioxygenasen typischerweise durchgeführt wird. Hydroxyl-Gruppe können dann mit Glykosyl- oder Acyl-Gruppe konjugiert werden. Diese Modularität eignet sich besonders gut für die kombinatorische Biosynthese.

Das Ziel von dem COMBIOSCREEN Projekt ist es, Bibliotheken von pflanzlichen Genen, die für Diterpen-Synthase, -Oxidase und andere Terpen- modifizierenden Enzyme kodieren, zu generieren  und diese mit Hilfe der modularen Klonierungstechnologie Golden Gate zu kombinieren. Diese Kombinationen werden in Hefe transformiert und in hohem Durchsatz mit Massenspektrometrie analysiert. Extrakte von den Genkombinationen, die neue Diterpenen produzieren, werden dann auf ihre anti-Tumor Aktivität getestet. Die einzelnen Substanzen werden gereinigt und identifiziert und ihre anti-Tumor Aktivität durch eine Reihe weiterer Tests im Detail charakterisiert, um den Wirkungsmechanismus zu entschlüsseln. Während der drei Jahre des Projektes sind die Produktion und Testung von über 500 Diterpenen vorgesehen.

COMBIOSCREEN ist ein interdisziplinäres Projekt in dem zwei Forschungsgruppen mit komplementären Expertisen, AG Tissier (IPB) für die kombinatorische Biosynthese und AG Köck (MLU) für die Anti-Tumor Testung, zusammenarbeiten werden. Die Firma Biosolutions GmbH hat sich bereit erklärt, die weitere Verwertung der Ergebnisse zu übernehmen.

Project Report Combioscreen 2020 zum Download:

ProjektReportCombioscreen.pdf (375,6 KiB)

INDUCEPROT – Induzierte Anreicherung von rekombinanten Proteinen im Gerstenendosperm

Dr. Götz Hensel (Leibniz Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung) in Kooperation mit Prof. Dr. Marcel Quint  (Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg)

Der Bedarf an hochwertigen rekombinanten Proteinen für pharmazeutische, diagnostische und industrielle Anwendungen ist stark ansteigend. Die Produktion erfolgt standardmäßig in tierischen, bakteriellen oder pilzlichen Zellkulturen, deren Anwendung allerdings oft aufgrund von hohen Produktions- und Investitionskosten zur Etablierung der zellulären Produktionssysteme stark limitiert sind. Pflanzen stellen gegenüber pro- und eukaryotischen Systemen in vielerlei Hinsicht ein sichereres, effizienteres und wirksameres Produktionssystem dar, da sie in der Lage sind auch komplexe Proteinmodifikationen durchzuführen. Allerdings ist die Ausbeute pflanzlicher Systeme bei vielen Zielproteinen noch nicht ausreichend, um mit mikrobiellen und tierischen Systemen konkurrieren zu können. Daher sollen in dem hier dargestellten Ansatz neuartige Techniken der Protein- und Pflanzenbiotechnologie kombiniert werden, um die Produktausbeute in pflanzlichen Systemen signifikant zu steigern. Unser Ansatz beruht auf der durch simple Temperaturwechsel auf- und abregulierbaren Produktion eines rekombinanten, endogenen Speicherproteins in Gerstenkörnern. Durch die gezielte Abregulierung des endogenen Proteins werden die zelleigenen Prozesse für die Akkumulation des gewünschten Zielproteins genutzt.  Projektziel ist die Generierung eines genetischen Hintergrundes für ein Proteinproduktionssystem, mit dessen Hilfe hochwertige diagnostische, pharmazeutische oder industrielle Zielproteine im Korn der Gerste (Hordeum vulgare) angereichert werden. Dazu wird eine Treiberlinie erstellt, die nach induzierender Behandlung die Akkumulation eines endogenen Speicherproteins im Endosperm zu Gunsten einer Anreicherung von exogenen Zielproteinen reprimiert. So soll eine erhöhte, gesteuerte Akkumulation des Zielproteins möglich werden. Die Treiberlinie mit gRNA/Cas9 ausgeschaltetem, endogenen Speicherprotein soll als genetischer Hintergrund eines Zweikomponentensystems eingesetzt werden, in dem die unter induzierenden Bedingungen gehemmte Anreicherung von rekombinanten Speicherprotein (Komponente 1) durch die eines Zielproteins (Komponente 2) ersetzt wird. Diese zweite Komponente führt zur Endosperm-spezifischen Expression und Akkumulation des Zielproteins in der Karyopse und füllt somit den Raum des „fehlenden“ Speicherproteins. Die ganze Reaktion findet im Endosperm statt, einem metabolisch hochaktiven, morphologisch abgeschlossenen Reaktionskompartiment – oder Bioreaktor. Diese Treiberlinie soll eine ergänzende Alternative zu bereits vorhandenen aber mitunter nur eingeschränkt einsetzbaren Verfahren, wie transienter Tabakexpression sowie Expression in pflanzlichen Zellkulturen oder in Plastiden, bereitstehen. In diesen Systemen können sich Einschränkungen durch Kontaminationen durch Krankheitserreger oder Allergene ergeben, die zur späteren Anwendung der Zielproteine aufwendig herausgereinigt werden müssen. In Prokaryoten fehlen posttranslationale Modifikationen, die oft für die Funktion des Wirkproteins essentiell sind. Durch Wahl der Kultivierungsbedingungen der Gerste kann zwischen Vermehrungs- oder Produktionsanbau unterschieden werden.

Project Report INDUCEPROT 2020 zum Download

ProjektReportINDUCEPROT.pdf (658,5 KiB)

MAGIC-RESIST – Identifikation effektiver Resistenzen gegen Roste und Fusarium in der MAGIC-WHEAT Population WM-800

Prof. Dr. Klaus Pillen und Dr. Wiebke Sannemann (Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg in Kooperation mit Prof. Dr. Frank Ordon und Dr. Albrecht Serfling (Julius Kühn-Institut)

Weizen ist mit ca. 215 Millionen Hektar eine der am meist angebauten Kulturpflanzen weltweit. Jedoch führt der Befall von Weizen durch Pathogene, wie Fusarium und Roste (Puccinia ssp), die zu den 5 bedeutendsten pathogenen Pilzen zählen, mit bis zu 23% zu erheblichen Ertragsverluste in Westeuropa. Daher ist die Identifikation und Lokalisation von quantitative trait loci (QTLs) und Genen von neuen, quantitativen Pathogenresistenzen die Grundlage für die Bereitstellung der erhöhten Weizennachfrage für menschliche und tierische Ernährung sowie als nachwachsender Rohstoff in den Non-Food Anwendungsbereichen.

Das Netzwerk MAGIC-RESIST, bestehend aus den wissenschaftlichen Partner MLU und JKI, den Weizenzüchtern KWS, RAGT 2n, Secobra und Syngenta sowie der Forschungs- und Züchtungsallianz proWeizen, widmet sich der Erforschung und Anwendung von multi-und hyperspektralen Aufnahmen zur frühzeitigen Erkennung und Differenzierung von Pathogenbefall im Freiland in der multi-parentalen Weizenpopulation WM-800 sowie der Lokalisation von QTLs und Resistenzgenen mittels genomweiter Assoziationsstudien.

Im Freiland werden bei den Partnern MLU und JKI die Genotypen mit drei Pathogenen, Gelbrost, Braunrost und Ährenfusarium, inokuliert und bonitiert. Am Standort MLU wird der Krankheitsverlauf zusätzlich mittels drohnengesteuerter Multispektralkamera zu mehreren Zeitpunkten erfasst. Kontrastierende Genotypen werden selektiert und unter kontrollierten Bedingungen mit einer Hyperspektralkamera erfasst (JKI). Zur Datenverifizierung wird der DON-Gehalt via ELISA ermittelt. Der krankheitsverlauf der Roste wird zusätzlich mittels eines Macrobot-Systems im Hochdurchsatzverfahren mikro-und makroskopisch erfasst. Die erhobenen Spektraldaten, die Bonituren, sowie die Ergebnisse der DON-Bestimmung und die hochauflösenden Daten des Macrobot werden statistisch verrechnet. Dabei wird die Assoziation der allelischen Variation der SNPs mit der quantitativen Variation der Merkmalsausprägung der Genotypen für jeden Krankheitsbefall und für die unterschiedlichen Erhebungsmethoden berechnet und verglichen, um QTLs und Gene, die für eine (quantitative) Pathogenresistenz verantwortlich sind zu lokalisieren und resistente Genotypen zu identifizieren.

Diese Genotypen stehen den assoziierten Züchtern zu Verfügung und werden in deren Resistenzzuchtprogramm aufgenommen. Des Weiteren ermöglichen die gewonnenen Ergebnisse aus dem MAGIC-RESIST Netzwerk (1) präzisere Phänotypisierung von Kulturpflanzen, (2) die Anwendung spektraler Hochdurchsatzphänotypisierung zur Detektion von Pflanzenkrankheiten im züchterischen Betrieb, (3) schnelle Selektion von resistenten Genotypen in Kombination mit markergestützter Selektion, (4) die direkte Anmeldung von resistenten Sorten aus der WM-800, (5) die Entwicklung von KASP-Markern zur markergestützten Selektion aus den identifizierten QTLs.

Project Report Magic Resist 2020 zum Download

ProjektReportMagicResist.pdf (1,1 MiB)

Development of new phytoeffectors reducing drought stress (Phytoeffectors)

Prof. Dr. Ludger Wessjohann (Leibniz-Institut für Pflanzenbiochemie) in Kooperation mit Prof. Dr.  Edgar Peiter (Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg)

Trockenheit, vor allem in Frühjahr und Sommer, ist in der Landwirtschaft der bedeutendste Faktor für Ertragsverluste. Die Anwendung von Phytoeffektoren ist ein möglicher Weg die Ertragsstärke der Pflanzen zu erhöhen. Phytoeffektoren sind kleine Molekülen, welche die Reaktion der Pflanze auf externe Stimuli wie Trockenheit verändern. Dabei ist keine genetische Manipulation der Pflanzen nötig, die Anwendung erfolgt temporär und lokal, ist für verschiedene Nutzpflanzen anwendbar und die bekannten Methoden zur Ausbringung von Dünge- und Pflanzenschutzmitteln können verwendet werden. Die Entwicklung von neuen Phytoeffektoren, die unseren Nutzpflanzen helfen Trockenperioden besser zu überstehen, ist ein wichtiger Schritt um Erträge zu verbessern und es wird erwartet, dass dies ein Milliarden-Euro-Markt wird.

Die Reaktionen von Pflanzen auf Trockenstress sind unterschiedlich, aber die meisten verwenden das Pflanzenhormon Abscisinsäure (ABA) um einen Teil ihrer Reaktionen zu regulieren. Unter Trockenstress steigen die internen Konzentrationen von ABA und führen zum Schließen der Spaltöffnungen, ändern das Genexpressionsmuster und lassen die Pflanze eine Stressphase überleben. Experimente mit gentechnisch veränderten Pflanzen zeigen, dass durch eine Verzögerung des ABA-Abbaus eine verstärkte Trockenstresstoleranz entsteht. Das für den ABA-Abbau verantwortliche Protein CYP707A kann aber auch durch kleine Moleküle inhibiert werden und die Pflanzen sind dann ebenfalls trockenstresstoleranter. Die Auswahl an bekannten Phytoeffektoren gegen Trockenstress ist klein, der Bekannteste (Imidacloprid, ein Insektizid) ist wegen seiner Nebeneffekte kritisch zu sehen.

In unserer vorhergehenden Forschung konnten durch virtuelles screening mit einem CYP707A-Modell neue Strukturen, die noch nicht als Pflanzenschutzmittel bekannt sind, gefunden werden. Diese Verbindungen zeigten in einem Trockenstressassay mit Weidelgras einen deutlichen positiven Effekt auf die Pflanzen.

Das Ziel dieses Projektes ist die Validierung der molekularen Zielstruktur und die Weiterentwicklung der anfänglichen Verbindungen (Screening-„Hits“) in Leitstrukturen mit Entwicklungspotential für den Pflanzenschutz. Zur strukturellen Optimierung werden Methoden der medizinischen Chemie (Computermodelle und Synthese von Derivaten), der analytischen und der Pflanzenbiochemie verwendet. Mit Hilfe eines neuen in vitro Enzymassays sowie verschiedenen Trockenstressassays mit ganzen Pflanzen (Weidelgras und Gerste) sollen die Aktivität, die Löslichkeit und die Aufnahme über das Blatt verbessert werden. Die Messung dieser Verbindungen in Wurzel und Spross führt zu zusätzlichen Informationen. Solche Aufnahme- und Verteilungs-Messungen („ADMET“) stellen ein bisher wenig systematisch behandeltes Gebiet der Pflanzenforschung dar. Schlussendlich erwarten wir eine neue Leitstruktur, optimiert für die Anwendung an der Pflanze, welche weiterentwickelt werden kann für die Feldanwendung, Registrierung und Produktion.

Project Report Phytoeffectors 2020 zum Download

Weed control by biological compounds identified in necrotizing plant pathogenic fungi (WOLF)

Prof. Dr. Holger Deising und Prof. Dr. René Csuk (Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg) in Kooperation mit Dr. Norbert Arnold (Leibniz Institut für Pflanzenbiochemie)

Kontrolle von Unkräutern durch herbizide Substanzen aus nekrotisierenden pflanzenpathogenen Pilzen

Im globalen Maßstab variieren die potenziellen Verluste in der Pflanzenproduktion von 50% im Weizen bis zu mehr als 80% in der Baumwolle. Unter den Schaderregern verursachen die Unkräuter und -gräser mit 34% die größten Verluste. Aufgrund dieser enormen Zahl ist es nicht erstaunlich, dass erwartet wird, dass der globale Herbizidmarkt bis zum Jahr 2022 insgesamt $34.1 Milliarden erreichen wird. Die kontroversen Diskussionen um das Risiko, das von chemisch-synthetischen Herbiziden (z.B. Glyphosat) ausgeht, erklären den Wunsch nach einer bio-kompatiblen Unkrautbekämpfung. In der Tat sind die Umsätze im Bereich der Bio-Herbizide mit einer jährlichen Wachstumsrate (23.5% im Vorhersagezeitraum 2016 - 2022) erheblich. In dem hier vorgeschlagenen Projekt werden wir hochgradig destruktive pflanzenpathogene Pilze verwenden, um neue biokompatible herbizide Leitstrukturen zu identifizieren. Diese Strukturen werden zur Optimierung ihrer Wirkung chemisch modifiziert.

Project Report Wolf 2020 zum Download

ProjektReportWolf.pdf (674,3 KiB)